革兰氏染色要求菌种被染色时处于活跃生长期。此时菌体的细胞壁成分和结构最为典型，经革兰氏染色液处理后，能正确地反映染色的结果。若菌体细胞未成熟或已经老化，染色结果可能会出现完全相反的情况。大肠杆菌的活跃生长期为24 h左右，枯草芽孢杆菌活跃生长期为在14~16 h，故选择从18~32 h的范围，分10个时间段进行涂片染色，实验结果见表1。

由表1可以看出，培养时间在23~25 h的大肠杆菌和培养时间在14 ~16h的枯草芽孢杆菌均能得到正确的染色结果，但培养时间超过25h后，有一半以上枯草芽孢杆菌出现阴性反应。出现阴性反应的枯草芽孢杆菌发现其有很多菌体已不呈典型杆状，显然由于培养时间过长，菌体已经死亡或部分自行溶解，造成细胞壁通透性增大而呈假阴性。

用直径3mm的接种环分别挑起培养24h的大肠杆菌和培养15h的枯草芽孢杆菌满环、半环、甚至更少量涂片，使细菌在一滴纯净水中涂成直径为12~ 15mm的片状，作革兰氏染色后观察。每种情况涂片20张，作革兰氏染色观察，如表2所示。

由表2结果显示，涂片浓厚时，菌体明显堆积在一起，因大肠杆菌密集不易脱色或脱色不完全而呈G⁺反应：而桔草芽孢杆菌涂片浓厚时，以至残留大量结晶紫，经番红复染后观察不到典型的蓝紫色而常常呈现紫色。因而无论大肠杆菌还是枯草芽孢杆菌涂片时均匀分散才能得到正确的结果。

将培养24h的大肠杆菌和培养15h左右的枯草芽孢杆菌染色，用碘液作媒染剂，覆盖时间分别为30s、60s、90s、120s。各涂片20张，实验结果见表3。

由表3可以看出，媒染时间过短，不利于初染液结晶紫与细胞之间的结合，因而可能造成阳性菌呈阴性结果；反之，媒染时间过长，容易使阴性菌呈假阳性。媒染时间应控制在60s左右为宜。

革兰氏阴性菌细胞壁疏松，脂类含量高，肽聚糖含量低。因此用乙醇脱色时，G⁻菌的脂类物质易被酒精溶解，致使细胞壁通透性受到影响，细胞内的结晶紫—碘复合物易被乙醇溶解脱出，使菌体无色。因此，若脱色时间过长，革兰氏阳性菌也有可能被脱色，成为假阴性菌。同样若脱色时间不足，革兰氏阴性菌细胞壁的部分类脂质未被乙醇溶解，使结晶紫—碘复合物不能被洗脱出来，成为假阳性菌。实验结果见表4。

表4结果显示，乙醇脱色时间不够，阴性菌可能被染成阳性菌，虽然只差10s、 20s, 但染色结果相差较大。因此，革兰氏染色要严格控制脱色时间，一般以30~60s为宜。

通过对实验结果进行分析，可以看出：菌龄、细菌密集程度、媒染时间、酒精脱色程度等会影响革兰氏染色的正确性。菌龄对革兰氏染色的结果有较大的影响，且与活跃生长期的时间差距越大，影响也越大；菌龄对革兰氏阴性菌的染色结果的影响较阳性菌大。其机理尚待研究，可能与阴性菌细胞壁结构中类脂质的生成、降解变化有关。菌龄提前较之菌龄推迟对染色结果的影响小得多。脱色时间延长只对革兰氏阳性菌的染色结果有影响，对革兰氏阴性菌影响较小。而脱色时间缩短只对革兰氏阴性菌的染色结果有影响，对革兰氏阳性菌无影响。延长脱色时间对革兰氏阳性菌染色结果的影响较大，但继续延长其影响变化不大。因此在进行革兰氏染色实验教学和科研工作中，一定要按操作规范控制好菌龄和脱色时间，这样才能保证染色结果的典型性和准确性。

收稿日期：2008一05—21

作者简介：王芳(1971一)，女，山东人，硕士，实验师，主要从事微生物学实验教学和管理工作。

期刊资料

浮游菌采样器（空气微生物采样器）

空气微生物气溶胶采样器